DB33_T 963-2015 厚皮甜瓜种子纯度分子标记鉴定方法
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ID： |
C0DC79170FCB4C749EC2AE292F5B3D13 |
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0.27 |
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8 |
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日期： |
2015-5-19 |
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ICS 65.020.01,B 05,DB33,浙江省地方标准,DB 33/T 963—2015,厚皮甜瓜种子纯度分子标记鉴定方法,Purity identification of Musk melon variety using molecular marker analysis,2015 - 05 - 07发布,2015 - 06 - 07实施,浙江省质量技术监督局 发布,DB33/T 963—2015,I,前 言,本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草,本标准由浙江省农业厅提出,本标准由浙江省种植业标准化技术委员会归口,本标准起草单位：宁波市农业科学研究院、宁波市种植业管理总站,本标准主要起草人：宋慧、王毓洪、张香琴、臧全宇、陆惠斌、张庆、范雪莲,DB33/T 963—2015,1,厚皮甜瓜种子纯度分子标记鉴定方法,1 范围,本标准规定了厚皮甜瓜种子纯度分子检测方法的术语与定义、原理、试剂、仪器设备、操作步骤和样品纯度判定与计算,本标准适用于厚皮甜瓜种子纯度鉴定,2 规范性引用文件,下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件,农业部1485号公告-4-2010 转基因植物及其产品成分检测 DNA提取和纯化,3 术语与定义,下列术语和定义适用于本标准,3.1,品种纯度,品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示[GB/T 3543.5-1995，定义3.2],3.2,杂株,某差异位点杂交失败，该位点纯合的单株,3.3,杂种一代,某差异位点杂交成功，该位点杂合的单株,3.4,显性标记位点,仅能检测显性等位基因，不能够区分纯合和杂合基因型的遗传标记位点,3.5,共显性标记位点,DB33/T 963—2015,2,同时能检测出显性和隐性等位基因，能够区分纯合和杂合基因型的遗传标记位点,3.6,随机扩增多态性DNA标记（RAPD）,以基因组DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列（通常为10个碱基对）为引物，在热稳定的Taq DNA聚合酶作用下，进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上检测多态性,3.7,简单重复序列标记（SSR）,根据真核生物中广泛存在的简单重复序列两端的互补保守区域设计引物。由于核心序列串联重复数目不同，PCR扩增后获得的产物长度不同，通过高分辨率琼脂糖凝胶电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上检测多态性,4 原理,从厚皮甜瓜幼苗新叶中提取基因组DNA，利用分子标记进行PCR扩增，扩增产物在琼脂糖凝胶的分子筛效应和电泳分离的电荷效应作用下进行分离。通过溴化乙锭（EB）染色，在紫外光下发出荧光显示核酸谱带差异。不同厚皮甜瓜品种由于遗传组成不同，引物结合后扩增产物不同，出现扩增产物有和无、或者扩增片段大小不同的差异。这些差异可利用电泳图谱加以鉴别，从而对种子纯度进行鉴定,5 试剂,除非另有说明，仅使用分析纯试剂和去离子水,5.1 引物,5.1.1 RAPD,RAPD（ Random Amplified Polymorphic DNA）引物名称、序列及差异片段大小见表1,表1 RAPD引物名称、序列及差异片段大小,名称,序列（5’-3’）,差异片段大小（bp）,RAPD-1,ACCTGGACAC,1200/1400,RAPD-2,CCACATCGGT,1200/1300,RAPD-3,ACACCGGAAC,1500,RAPD-4,CCGAACACGG,460/550,5.1.2 SSR,SSR（Simple Sequence Repeat）引物名称、序列及差异片段大小见表2,DB33/T 963—2015,3,表2 SSR引物名称、序列及差异片段大小,名称,F-序列（5’-3’）,R-序列（5’-3’）,差异片段大小（bp）,SSR-1,CAAAGGGCTACAATAAC,CATCATAATCACCCTATCTC,225/350/400/450,SSR-2,CAGCTCTACAACAACATCTC,ATCCAACTCGACCAAGAAAC,120/130/140/550/600,SSR-3,TGAAGAGACTACCATCCCCA,TTTCCTTATGAGTTAGGGTTTC,140/150/320/350,5.2 琼脂糖,5.2.1 RAPD使用2%普通标准凝胶琼脂糖（DNA片段分离范围500 bp～20000 bp）,5.2.2 SSR使用2.5%高分辨率标准凝胶琼脂糖（DNA片段分离范围40 bp～1000 bp）,5.3 10 g/L溴化乙锭溶液,称取1.0 g溴化乙锭（EB），溶于100 mL水中。配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液,5.4 10 mol/L氢氧化钠溶液,称取80.0 g氢氧化钠（NaOH），先用160 mL水溶解后，再加水定容到200 mL,5.5 0.5 mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH 8.0）,称取18.6 g乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2），加入70 mL水中，再加入2 g氢氧化钠，加热至完全溶解后，冷却至室温，用按本标准5.4配置氢氧化钠溶液调pH至8.0，加水定容至100 mL。在103.4 kPa（121 ℃）条件下灭菌20 min,5.6 1 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH 8.0）,称取121.1 g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800 mL水中，加入42 mL盐酸，搅拌均匀。用……
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